ÖZET
Amaç:
Alerjik hastalıkların fizyopatogenezinin daha iyi anlaşılması ve yeni ilaçların geliştirilmesi için yapılacak çalışmalarda kullanılmak üzere insandaki alerjik konjonktiviti simüle eden bir hayvan modeli geliştirmek.
Gereç ve Yöntem:
On iki erkek Balb/c fare, her birinde 6 fare bulunan 2 gruba ayrıldı. Duyarlılaştırma için, Grup 1’deki farelere, birinci ve sekizinci günlerde, 5mg/ml ovalbümin (OVA) ve 15mg/ml aliminyum hidroksit karışımının 0,2 ml’lik solüsyonu; Grup 2’deki farelere ise 0.2 ml’lik salin solüsyonu intraperitoneal olarak injekte edildi. Deneysel alerjik konjonktiviti indüklemek için, Grup 1’deki farelerin gözlerine OVA solüsyonu (5mg/ml) ile 15. ve 18. günlerde antijen uyarımı (challenge) yapılırken; Grup 2’deki farelerin gözlerine ise Human Balanced Salt Solution damlatıldı. Klinik inceleme için konjonktival ödem, palpebral ödem, konjonktival hiperemi ve sulanma değerlendirildi. Histopatolojik inceleme için eksize edilen göz küreleri, göz kapakları ve lakrimal glandları, doku laboratuvarının rutin proçesine uygun olarak hazırlandı. Hematoksilen-Eozin ve Toluidin Blue boyamalarına ek olarak Mast-hücre triptaz ile Labeled Streptavidin–Biotin amplifikasyon yöntemi ve 3,3´-diaminobenzidine kullanılarak immünohistokimyasal değerlendirme yapıldı.
Sonuçlar:
Grup 1’deki farelerin gözlerinde belirgin olarak palpebral ve konjonktival ödem oluştuğu, sulanma ve konjonktival hiperemi ortaya çıktığı gözlemlendi. Grup 2 (5,58±3,12) ile karşılaştırıldığında, subkonjonktival dokuyu infiltre eden ortalama mast hücre yoğunluğu hücre/mm2 olarak, anlamlı olarak Grup 1’de (alerji grubu, 23,17±7,46, p<0,0001) yüksek bulundu. Her iki grupta da subkonjonktival dokuda eozinofil ve lenfosit sayısında ve vasküler yoğunlukta artış izlenmedi.
Tartışma:
Geliştirilen fare modeli insanlardaki alerjik konjonktivite klinik ve patofizyolojik açıdan benzerlik göstermektedir ve yapılacak yeni çalışmalara temel oluşturacak niteliktedir.(Turk J Ophthalmol 2012; 42: 418-22)
Giriş
Çalışmaya 8-12 haftalık 12 erkek Balb/c fare dahil edildi. Fareler Adnan Menderes Üniversitesi Farmakoloji Departmanı’ndan temin edildi. Bütün farelere, araştırmalarda kullanılacak deney hayvanları ile ilgili olarak, Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) kurallarına uygun biçimde davranıldı ve bakım verildi. Fareler; alerji grubu (pozitif kontrol) ve negatif kontrol grubu olmak üzere, sırasıyla Grup 1 ve 2 olarak adlandırılarak 2 gruba ayrıldı. Her grupta 6 fare bulunmaktaydı. Deneysel alerjik konjonktivit fare modelinin oluşturulması Tablo 1’de gösterilmiştir.
Duyarlılaştırma
Tablo 1’de anlatıldığı gibi; duyarlılaştırma için, Grup 1’deki farelere, birinci ve sekizinci günlerde 5mg/ml ovalbümin (OVA) ve 15mg/ml aliminyum hidroksit karışımının 0,2 ml’lik solüsyonu intraperitoneal olarak enjekte edildi (Resim 1). Grup 2’deki farelere ise 0,2 ml’lik salin solüsyonu intraperitoneal olarak enjekte edildi.
Antijen Uyarımı
Deneysel alerjik konjonktiviti indüklemek için, Grup 1’deki farelerin gözlerine OVA solüsyonu (5mg/ml) ile 15. ve 18. günlerde antijen uyarımı (challenge) yapıldı (Resim 2). Grup 2’deki farelerin gözlerine ise Human Balanced Salt Solution (HBSS) uygulandı.
Klinik Değerlendirme
Antijen uyarımından 20 dakika sonra, farelerin hangi gruplarda olduğunu bilmeyen bir gözlemci tarafından, farelerin klinik durumları değerlendirildi ve konjonktivit olup olmamalarına bakıldı. Klinik olarak; konjonktival ödem, palpebral ödem, konjonktival hiperemi ve sulanma olmak üzere dört ana kriter değerlendirildi.
Histopatolojik İnceleme
Histopatolojik incelemeler tek kör olarak gerçekleştirildi. Farelerin gözlerine 18. günde uygulanan son doz OVA solüsyonu damlatıldıktan 12 saat sonra, tiyopentotan sodyum (Pentothal Sodium; Abbott Laboratories Inc.) ile sakrifikasyonu takiben bütün gruplardaki farelerin göz küreleri, göz kapakları ve lakrimal glandları çıkarıldı. Her farenin bir gözü histopatolojik değerlendirme için; diğer gözü ise moleküler biyolojik inceleme için kullanıldı.
Bütün örnekler, doku laboratuarının olağan akışına uygun olarak, %10’luk nötral tamponize formol ile sabitlendi ve parafine gömüldü. Hematoksilen-Eozin (HE) ve Toluidin Blue (TB) işlemlerine ek olarak Mast-hücre triptaz boyaması için kullanıma hazır olan 4-μm kalınlığındaki yapışkanlı cam slaytların (MicroSlides Snowcoat X-tra; Surgipath, Richmond, IL, USA) üzerine yerleştirildi.
İmmünohistokimyasal incelemeye, labeled Streptavidin-Biotin (LSAB) amplifikasyon yöntemini ve kromojen (Histostain-Plus kits, cat.no. 85-9643; Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA) olarak 3,3´-diaminobenzidine (DAB) kullanan ticari olarak elde edilebilir bir tarama kiti ile devam edildi.
Kesitler, Mast-hücre triptaza karşı oluşturulmuş olan fare anti-insan monoklonal antikorları kullanılarak incelendi. Kesitler ksilen içinde deparafinize ve derecelenmiş etanol solüsyon serilerinde dehidrate edildikten sonra 0,01 M sodyum sitrat tamponunda 20 dakika mikrodalga antijen gerialımına tabi tutuldu. Endojen peroksidaz aktivitesi, 15 dakikalık %3’lük hidrojen peroksit ile inhibe edildi. Tris-buffered salin (TBS; pH 7,6) içinde yıkandıktan sonra, kullanıma hazır solüsyon kiti ile 10 dakika serum blokajı gerçekleştirildi. Kesitler, 1 saat boyunca, primer antikor ile inkübe edildi, TBS içinde yıkandı; biotinlenmiş sekonder antikor ile 10 dakika inkübe edildi ve tekrar TBS ile yıkandı. DAB ile ve hematoksilen ile hafif zıt boyanmaya uğrayan kesitlerin inkübasyonu ile bağlanma görünür hale getirildi.
HE, TB ve immünohistokimyasal boyanan örneklerin hepsi ışık mikroskobu (Olympus BX50, Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan) altında incelendi. Subkonjonktival doku, mast hücreleri, eozinofiller, lenfositler ve vasküler yoğunluk açısından 40x güç altında, 50 farklı bölgede basit mikrometrik 10x10 grid disk kullanılarak incelendi.
İstatistiksel Analiz
Farklı gruplardaki hücre yoğunluklarını karşılaştırmak için Mann-Whitney U testi uygulandı. 0,05’den küçük bir p değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Gereç ve Yöntem
Duyarlılaştırma ve antijen uyarımı sonrasında, klinik açıdan da incelenen farelerin gözlerini ovuşturdukları gözlemlendi. Ayrıca, Grup 2 ile karşılaştırıldığında, Grup 1’deki farelerde belirgin olarak palpebral ve konjonktival ödem oluştuğu, oküler sekresyon ve konjonktival hiperemi ortaya çıktığı gözlemlendi. Grup 2’deki farelerde ise bu bulguların hiç biri yoktu.
Grup 1 ile karşılaştırıldığında (23,2±7,5 hücre/mm2), subkonjonktival dokuyu infiltre eden ortalama mast hücre yoğunluğu Grup 2’den (5,6±3,1 hücre/mm2) istatistiksel olarak anlamlı derecede fazla bulundu. (p<0,0001), (Şekil 1, Tablo 2, Resimler 3, 4 ve 5). Hiçbir grupta, subkonjonktival dokuda eozinofil ve lenfosit sayısında ve vasküler yoğunlukta artış izlenmedi. Deney, her grup için 4’er fare kullanılarak ikinci kez tekrar edildi ve benzer sonuçlar elde edildi.
Bulgular
Akut ve kronik alerjik konjonktivitlerin her ikisi de dünya genelinde oldukça yaygındır.2 Alışılmış tıbbi yaklaşım, ilk aşama olarak topikal anti-histaminik ilaç kullanmak; gerekirse topikal kortikosteroid eklemektir. Ancak, kortikosteroidlerin özellikle kronik kullanımı, katarakt ve glokom gibi iyi bilinen yan etkilerin gelişmesine neden olabilir.
Oluşturduğumuz modelde farelerde belirgin olarak palpebral ve konjonktival ödem oluştuğu, oküler sekresyon ve konjonktival hiperemi ortaya çıktığı gözlemlendi. Konjonktival dokularda, mast hücre infiltrasyonu yönünden Grup 1 (pozitif kontrol) ve Grup 2 (negatif kontrol) arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı idi. Subkonjonktival dokuyu infiltre eden ortalama mast hücre yoğunluğu Grup 1 (pozitif kontrol) ile karşılaştırıldığında (23,2±7,5 hücre/mm2), Grup 2 (negatif kontrol)’de (5,6±3,1 hücre/mm2) istatistiksel olarak anlamlı ölçüde düşük bulunmuştur (Mann-Whitney U test, p<0,0001).
Alerjik göz hastalığında alınan konjonktival biyopsi çok sayıda metakromatik olarak boyanmış mast hücresi ile karakterizedir.3 Doku mast hücreleri, Tip 1 hipersensitivite reaksiyonunda majör rolü oynamaktadır. İmmünohistokimyasal işaretleyici olarak kullanılan nötral proteaz ve triptaz varlığında, bütün alerjik hastalık tiplerinde, Ig E aracılı mast hücre aktivasyonunu işaret eden bir durum olarak, mast hücre sayılarının artmış olduğu görülür.4-6 Mast hücresi, akut reaksiyonun tetikleyicisi olarak ve aktivasyonun geç faz cevabı ile devam etmesini sağlayarak, alerjik göz hastalığı mekanizmasının merkezinde yer alır. Buna ek olarak, mast hücreleri, alerjik göz hastalığındaki multifonksiyonel rolleri olan sitokinlerin önemli bir kaynağıdır; bu da mast hücrelerinin alerji mekanizmalarında merkezi bir göreve sahip olduklarını işaret eder. Mast hücrelerinin degranülasyonları sadece “mevsimsel alerjik konjonktivitin ani semptomlarından sorumlu olmayıp, aynı zamanda oküler alerjinin bütün tiplerindeki konjonktival inflamasyonun hızlı bir şekilde up-regüle edilmesini de sağlayan depolanmış sitokinlerin Ig E aracılı salınımlarına da” öncülük eder.7
Eozinofil, gözdeki alerjik hastalık sürecine katkıda bulunan diğer bir hücredir. Shoji ve ark.8 deneysel fare alerjik konjonktivit modelinde, topikal deksametazon ve FK506 tedavilerinin her ikisinin de, eozinofillerin ve lenfositlerin subkonjonktival dokuya infiltrasyonu suprese etmede etkili olduğunu rapor etmişlerdir. Oysa, bahsedilen çalışmada oluşturulan akut alerji modelinde geç dönemde arttıkları bilinen eozinofillerin ve lenfositleri artması zaten beklenen bir sonuç değildir.
Akut alerjik konjonktival hastalık, bizim çalışmamızda olduğu gibi, mast hücrelerinin infiltrasyonu ile karakterizedir, eozinofillerin veya lenfositlerin değil.9-12 Ancak, mast hücrelerinin varlığı, alerjik göz hastalığının güçlü bir belirteci olmasına rağmen; konjonktival sürüntü sitolojisinde olmamaları alerjik hastalığı ekarte ettirmez.13 Atopik olmayan bireylerin normal konjonktiva epitelinde eozinofiller bulunmaz13, ancak vernal keratokonjontivit olarak bilinen kronik alerjik göz hastalığında konjonktiva epitelinde, subepitelinde ve gözyaşında sayıları çok yüksek değerlere ulaşabilir.14 Mast hücreler tarafından üretilen, platelet aktive edici faktör ve anaflaksinin eozinofilik kemotaktik faktörü, her ikisi de, mast hücrelerinden daha sonra sürece katılacak olan eozinofiller için kemotaktiktir. Bu nedenle, eozinofillerin akut fazda görülmesi beklenmez; daha çok alerjik konjonktivitin kronik fazında görülmeleri beklenir. Benzer biçimde, bizim çalışmamızda da, eozinofillerde, lenfositlerde veya subkonjonktival dokudaki vaskülarizasyonda artış gözlenmemiştir.
Histaminin konjonktiva üzerindeki, IL-1, IL-6 ve IL-8 üretiminin, ve intraselüler adezyon molekülü-1’in ekspresyonunun indüklenmesiyle oluşturduğu, proinflamatuar etkisinin, histamin salınımının inhibisyonu ile devam etmesi engellenir.15
Friedlaender’ın16 da çalışmasında tariflediği gibi; alerjik sürecin akut fazı ile ilintili olarak görülen klinik durumlardan, farelerin gözlerini ovuşturduklarını, palpebral ve konjonktival ödem oluştuğunu, oküler sekresyon ve konjonktival hiperemi ortaya çıktığını gözlemledik.
Histopatolojik olarak ise tıpkı insanlarda olduğu gibi; subkonjonktival dokuyu infiltre eden ortalama mast hücre yoğunluğunda artış oldu. Bonini ve ark.’nın17 rapor ettiği gibi geç dönemde görülmesi gereken subkonjonktival dokuda eozinofil ve lenfosit sayısında ve vasküler yoğunlukta artış izlenmedi.
Farelerde oluşturduğumuz deneysel akut alerjik göz hastalığı modelinin insanlarda görülen alerjik göz hastalığı ile klinik ve patofizyolojik açıdan aynı cevapları verdiği görülmektedir. Ülkemizde alerjik konjonktivit ile ilgili çok değerli çalışmalar mevcuttur.18,19 Modelimizi hazırlarken, üniversitemizde ve diğer araştırma merkezlerinde gelecekte yapılacak olan alerjik konjonktivit çalışmalarında rahatlıkla ve güvenle kullanılabilecek bir model oluşturmayı amaçladık. Alerjik hastalıkların fizyopatolojilerinin daha iyi ve detaylı olarak anlaşılması amacıyla ve/veya tedavilerinde kullanılabilecek yeni ajanların geliştirilmesi amacıyla yapılacak ileri çalışmalarda kullanılabilecek, oldukça basit, kısa sürede oluşturulabilen ve tekrarlandığında aynı sonuçların elde edilebildiği bir model oluşturduğumuzu düşünmekteyiz.
Bu çalışma, alerjik hastalıkların fizyopatogenezinin daha iyi anlaşılması ve yeni ilaçların geliştirilmesi için yapılacak çalışmalarda kullanılmak üzere, insandaki alerjik konjonktiviti simüle eden bir hayvan modeli geliştirmek amacıyla yapılmış, prospektif, randomize tek kör olarak gerçekleştirilmiş, deneysel bir çalışmadır. Çalışmamızın sonuçları, insanlardaki alerjik konjonktivitte görülen klinik ve patogenez ile oldukça benzerlik göstermesi ve tekrarlandığında aynı sonuçların alınması ile, modelimizin, etkin, güvenilir ve ekonomik bir model olduğunu göstermektedir. Modelimizin ileride yapılacak olan alerjik konjonktivit çalışmalarına önemli bir temel oluşturacağına inanmaktayız. Alerjik hastalıkların patogenezinin tüm detaylarıyla aydınlatılabilmesi için daha fazla deneysel ve klinik çalışmaya gerek vardır.
Teşekkür
Çalışmalarımızdaki katkılarından dolayı Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı’na ve Prof. Dr. Mustafa BİRİNCİOĞLU’na çok teşekkür ederiz.
Yazışma Adresi/Address for Correspondence: Dr. Tolga Kocatürk, Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Göz Hastalıkları Anabilim Dalı, Aydın, Türkiye
Tel.: +90 256 444 12 56 Gsm: +90 533 344 41 11 E-posta: [email protected]
Geliş Tarihi/Received: 11.05.2012 Kabul Tarihi/Accepted: 23.08.2012